固相合成多肽的聚合物載體及連接分子
1.聚合物載體?固相合成多肽需要有固相載體及連接固相與反應物的連接分子,正確選擇載體和連接分子決定著固相合成法的成功。固相合成多肽用的載體多數采用聚苯乙烯及二乙烯基苯和苯乙烯共聚物等高聚物的衍生物,如氯?樹脂、Pam樹脂、王氏樹脂和氨基樹脂等。載體樹脂的溶脹狀況對縮合試劑及羧基組分的自由擴散,對肽鏈之間的聚集等與縮合反應有關的因素有明顯影響。為了使載體有較好的溶脹性,且有較大的網絡空間足以容納不斷增長的較長的肽鏈,而且便于反應物進入載體的內部,一般均采用1%～2%交聯度的聚苯乙烯珠狀樹脂或微孔樹脂。
2.連接分子?固相合成多肽曾經使用過鍵合不同連接分子的聚合物,這些連接分子為含有氯甲基、巰甲基、酰氯基、對苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、鄰硝基芐醇基及二苯氯硅烷等的雙官能團化合物。一個理想的連接分子必須在整個合成過程中十分穩定,并在合成后可以定量的切割下來而又不破壞合成的目標分子。選擇適合的連接分子還應根據與樹脂相連的肽的C末端的結構類型,裂解后生成相應的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物。
固相合成多肽的檢測
即使是高效的偶聯技術,也不能保證酰化反應100%地進行。而且,當遇到立體障礙或Β2片層等序列時,偶聯反應的效率更大大下降。聚合物載體上總是有缺序或截序的多肽鏈,在解脫時,它們也進入到產物中,給分離帶來很大困難。因此,固相合成肽時,尤其是較長的肽時,每一個氨基酸的縮合率應該達到99.9%,否則得到的產物將非常不純。因此,監測每一步反應的進行過程顯得格外重要。
1?定性顏色反應 茚三酮顯色法(Kaiser法),是用茚三酮 顏色反應快速測定樹脂上的氨基,從而判定酰化反應是否完全。用茚三酮法檢測聚苯乙烯樹脂氨基的靈敏度可達到?5μmol/g。這樣的靈敏度已可檢測出縮合反應是否進行了99%以上。茚三酮檢測時,由于末端氨基酸殘基及序列不同,?出現的顏色強弱不同。天門冬氨酸(Asp)、天門冬酰胺(Asn)會產生很弱的藍色或淡棕色。生色試劑2,4,62三硝基苯磺酸與樹脂上氨基反應顯示橙紅色,靈敏度為5μmol/g樹脂。
Kaiser試劑包括：
A，6%茚三酮的乙醇溶液
B，80%苯酚的乙醇溶液
C，2%0.001MKCN的吡啶溶液
配制中的吡啶需要經過茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。還有其它檢測游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。
2?定量自由氨基檢測 水楊醛法,用于接肽后樹脂上殘余氨基的量以及去除保護基后總氨基量的測定,可以定量地檢測縮合反應以及脫除保護基的反應是否完全。如不完全即可及時反復處理。用2%水楊醛+6%吡啶的乙醇溶液同樹脂上的氨基反應(60℃,30～35分鐘),洗凈后,再用5%芐胺乙醇溶液將水楊醛置換下來(60℃,30分鐘),加芐胺的乙醇溶液稀釋后,讀315nm的光吸收值,計算氨基的量(Ε=4.36×?103)。此法對于—NH2在0.15μmol/mg樹脂以上的樣品的相對偏差在5%以內。
3 HPLC檢測部分保護的中間肽?在多肽合成中間,取少量的肽樹脂(3～10mg)進行裂解,乙醚沉淀,溶于適當溶劑中直接進行HPLC分析。裂解時肽的N-端保護基根據需要保留或脫除。當合成的肽是較短的極性肽時,可以保留保護基團,否則,在HPLC中保留時間太短,不利于分析。這個方法雖然比較麻煩,但所需時間較短,精確度較高。
反應溶劑
?二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)是肽固相合成中常用的溶劑,尤其是DMF對作用物和產物均具有溶解度高的優點而被廣泛應用于多種反應系統中。雖然, DMF有更好的溶解度,但沸點較高,需要減壓才能蒸去。而 且,副產物N-酰基脲在高介電常數的溶劑〔DMF,甲氰?(CH3CN),二甲亞砜(DMSO),H2O等〕中容易生成,而在低介 電常數的溶劑(CH2Cl2,CCl4,C6H6等)中比較不容易生成。在非極性溶劑中,N-保護氨基酸能與DCC很快地反應生成對稱酸酐。因此,只要反應物能夠溶解,應盡可能選用低介電常數的溶劑。在固相合成中,絕大多數都是采用DCM為溶劑,它比選用DMF為反應溶劑有消旋率小和N-酰基脲形成較慢兩點好處。在遇到羧基組分不易溶解時,可加數滴重蒸DMF助溶。
縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）
碳二亞胺型
主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC進行反應，由于反應中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，產生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其價格便宜，在液相合成中，可以通過過濾除去，應用仍然相當廣泛。EDC.HCl因為其水溶解性的特點，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而且也相當成功。但是該類型的縮合試劑的一個最大的缺點，就是如果單獨使用，會有比較多的副反應，但是研究表明如果在活化過程中添加HOBt，HOAt等試劑，可以將其副反應控制在很低的范圍。
鎓鹽型
鎓鹽型縮合試劑反應活性高，速度快，現在使用非常廣泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM），該試劑加入后，才能活化氨基酸。
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固相合成過程
1、羥基樹脂為載體的合成方法（Wang樹脂為例：圖1）
??Wang樹脂、PAM樹脂、HMPA樹脂、Sasrin樹脂等均在Linker結構中含有芐醇基。多數情況下把預制的N一保護氨基酸的對稱酸酐及催化劑DMAP(對二甲氨基吡啶)與羥基樹脂一起反應。在這種成鍵反應中。DMAP是必需的，但也由此帶來一些麻煩。例如，當某些位阻較大、反應活性較低的Fmoc-氨基酸需要較長的反應時間，而且DMAP的純度又不理想時。會發生部分Fmoc基被脫除，生成部分二肽的麻煩。更常見的危險是當Cys及His作為C端第一個氨基酸與羥基樹脂反應時，DMAP往往使這兩種氨基酸發生消旋化。對此，解決辦法是改用Cl-Trt樹脂與這兩種氨基酸鍵合，同樣可以生成酯型Linker。另一種解決辦法是用MSNT試劑[Fra I388, Ren 1998]，可以有效地免除Cys, ?His與多種羥基樹脂鍵合時的消旋化危險。
圖1
2.以三苯甲基樹脂樹脂為載體的合成方法（圖2）
?三苯甲基(trt)樹脂含有三重芐基結構，因此反應活性極高。一般用等摩爾量的保護氨基酸及4倍量的DIEA與Trt樹脂混在二氯甲烷中，室溫反應30-12Omin即達完全。對于未反應完全的位點，可用甲醇封住位點。基于Trt Linker的溫和鍵合及溫和裂解特點，在此種樹脂上進行膚片段縮合及全保護基膚片段制備是較理想的方式。
FMOC固相合成Glu-Trp?
圖2
3以氨基樹脂為載體的合成方法
MBHA樹脂、PAL樹脂、Knorr樹脂、Rink-NH2樹脂等均在Linker中含有可與羧酸反應的氨基。C端第一個氨基酸與之鍵合的反應條件與接肽循環中的操作完全相同。如果以DCC為縮合劑，一般先將N-保護氨基酸與DCC、HOBT混于溶劑(DMF、THF、DCM等)中，生成氨基酸的HOBT活潑酯，放置3-5h，待活化反應基本完全后濾除副產物DCU沉淀，把羧基活化組分溶液與氨基樹脂混合進行鍵合反應。此步反應有兩點事項值得注意:①多數氨基樹脂的氨基并非以游離狀態出售。有的氨基是以鹽酸鹽的形式，有的則帶有臨時保護基(如Fmoc , ?Boc等），因此在與C端第一個氨基酸鍵合之前必須進行相應的中和或脫除臨時保護基的
處理;②氨基酸活化組分的用量應大大高于氨基樹脂組分，一般的摩爾比為（2-5）：1，目的是使鍵合反應接近100% ,因為未被酰化的氨基樹脂無法從產物中
清除出去。使用大大過量的構件是所有固相有機合成的共同之處。
?????除了DCC之外，其他常見的縮合劑還有DIC、EDC、EEDQ、HBTU等。